岑祥生命科學小學堂

《Science》、《Nature Medicine》、《Journal of Clinical Oncology》等多項研究證實：血液循環腫瘤細胞（CTCs）和稀有免疫細胞，在腫瘤治療中發揮著重要作用。

CTCs再立戰功- CTCs研究在全球臨床應用中獲得很大的進步和發展：《Journal of Clinical Oncology》發表於美國FDA與紀念斯隆—凱特琳癌症中心展開的一項聯合研究（5項III期臨床試驗，共計6,081例患者），發現CTCs可作為轉移性去勢抵抗性前列腺癌患者用藥早期療效評估的指標【1】。《JAMA Oncology》發表的期刊也指出隨機對照研究E5103聯合展開二次分析（雙盲III期臨床試驗，共計4,994例患者），發現CTCs可以為乳腺癌患者晚期臨床復發風險提供可靠的預後資訊【2】。2020年《Science》發表通過研究CTCs證明導致轉移CTCs的分子標籤是“核糖體相關基因”，發現抑制核糖體翻譯的藥物和阻斷乳腺癌增殖的靶向藥一起使用，可顯著抑制、阻止乳腺癌轉移的發生【3】。2018年1月1日在全球啟用的美國AJCC第八版指南將CTC列為繼ER/PR、HER2、Ki67和腫瘤組織學分級四項生物學指標之後，又一項乳腺癌預後評估工具，認為乳腺癌外周血中存在CTC提示預後不良【4】。

稀有免疫細胞研究證實：PD-1+CD8+T細胞特種部隊戰鬥力驚人：研究發現腫瘤細胞的刺激使淋巴系統產生大量的功能性免疫細胞，再運送到腫瘤組織周圍，《Nature Medicine》發表研究說明從腫瘤患者的外周血裡也可以分離得到腫瘤突變特異性的T細胞，有助於免疫治療的進一步研究【5】。《The Journal of Clinical Investigation》發表美國NIH的科學家的研究成果，說明PD-1+CD8+T細胞是攻擊腫瘤細胞的主要族群【6】。另一篇《Nature Medicine》論文說明對非小細胞肺癌患者，用PD-1免疫阻斷劑治療時，PD-1+CD8+T細胞比例高的人，對免疫治療反應較好【7】。2019年《Nature Medicine》期刊更宣布發現一個全新的免疫抑制靶點Siglec-15，或可補齊PD-(L)1短板，阻斷Siglec-15會引起腫瘤免疫微環境的改變，相關臨床試驗已經展開【8】。自身免疫性疾病研究也有突破：2020年《Cell》刊文揭示某種稀有免疫細胞是自身免疫性疾病的根源【9】。

以上研究都涉及到CTCs、稀有免疫細胞等稀有細胞的檢測和分析。稀有細胞含量極其稀少，在每毫升全血大概40億～60億個細胞中僅有不到100個，易受其他細胞成分幹擾，所以分離富集非常困難。因此高純度、高回收率（不丟失稀有細胞）、快速、高細胞活性的稀有細胞分離、與分析是臨床及科研應用的重點。

 MiSelect R“稀有細胞高效獲取分析系統”是目前唯一一款可收集稀有細胞與鑒定於一體的全自動化設備，技術法寶包括微流控技術、鐳射分選、體積過濾和多通道螢光標記成像，既可以從全血中直接分離富集各類稀有細胞，進行計數、分析和鑒定（生物標誌物分析），又可以獲得高捕獲率、高純度、高活性的稀有細胞，並進行後續培養和基因分析。全過程單機集成、自動運行，可從8mL全血中回收僅有1顆的稀有細胞！對生物標誌物的分析包括：

CTCs的生物標誌物分析：

1. 檢測CTCs中特定抗原HER-2、EGFR、MUCI等的表現量；
2. 檢測CTCs的PD-L1免疫檢查點標誌物的表現量，用於篩選適用於PD-1/PD-L1檢查點抑制劑免疫治療（如: Opdivo、Keytruda等）的患者。

稀有免疫細胞的生物標誌物分析：

1. 稀有功能性免疫細胞的分型分析；
2. 檢測T細胞的PD-1免疫檢查點標誌物的表達及表達量，用於篩選適用於PD-1/PD-L1檢查點抑制劑免疫治療（如: Opdivo、Keytruda等）的患者；
3. 檢測T細胞的二代免疫檢查點標誌物的表達及表達量 (如: TIM-3, LAG-3等)，用於篩選適用於相應的免疫檢查點抑制劑的患者。

圖1. Miselect R“稀有細胞高效獲取分析系統”。

MiSelect R的操作方式

步驟一、全血直接標記上樣—保留稀有細胞

步驟二、鐳射分選—通過微流控晶片和eDAR技術，篩選所需之細胞

圖2. 微流控雷射分選【10】。

步驟三、過濾收集——過濾掉雜質細胞，保留目標稀有細胞

圖3. 微流控過濾【10】。

步驟四、多重螢光標記成像分析—收集純化的細胞在晶片上自動完成固定、染色、清洗及成像。全自動化圖像採集，高解析成像分析，鑒定出稀有細胞

圖4. 微流控螢光標記成像分析（CTCs為例）【10】。

另外，我們也能通過微流控晶片和兩步eDAR技術，回收高活性的稀有細胞。

圖5. 回收高活性的稀有細胞【10】。

• 準確度、重複性和特異性

圖6是MiSelect R對SkBr-3（EpCAM高表達）和MDA-MB-231（EpCAM低表達）的靈敏度（回收率）、特異性、精密度。表明MiSelect R系統對EpCAM表達水準低的CTCs也有較高的靈敏度。系統檢測的CV值均＜10%，特異性100%。

圖6. MiSelect R檢測的回收率、特異性、精密度【10】。

CTCs的應用

CTCs的應用非常廣泛，目前先列舉三個常用應用，如下：

3.1 轉移性乳腺癌患者CTCs上HER2的表達分析

檢測轉移性乳腺癌患者CTCs上HER2的表達分析，結果顯示同一患者和不同患者CTCs上的HER2表達均具有異質性，MiSelect R檢測的CTCs上HER2的狀態顯示與病理評估一致，見圖7。

圖7. 檢測轉移性乳腺癌患者CTCs上HER2的表達分析【11】。

3.2 腫瘤患者CTCs中PD-L1的表達

對結直腸癌和頭頸癌患者血液樣本中的CTCs進行計數和PD-L1的表達分析，結果顯示，同一患者和不同患者CTCs中的PD-L1表達均具有異質性，見圖8。且臨床研究發現， 結直腸癌CTCs上PD-L1的表達與腫瘤分期及多個臨床病理指標具有高度相關性，見圖9。

圖8.結直腸癌和頭頸癌患者CTCs上PD-L1的表達分析【11】。

  圖9.結直腸癌MVB CTCs上PD-L1的表達與腫瘤分期及多個臨床病理指標具有高度相關性【12】。

3.3 對外周血CTCs進行基因測序分析

MiSelect可捕獲外周血中單顆CTC，用“RT-PCR”方式可以在單顆CTC上分析超過11種基因（圖10）。非小細胞肺癌（NSCLC）患者，酪氨酸激酶抑制劑（TKI）治療失敗，化療失敗，嘗試用MiSelect R獲取外周血CTCs進行基因檢測，對3顆CTC進行了EGFR突變分析，指導患者用藥 (圖11)。

圖10. 外周血捕獲的單顆CTC可以進行高達11種的基因分析【12】。

圖11. 肺癌病患外周血中捕獲的3顆CTC，進行EGFR基因突變分析【12】。

• 稀有免疫細胞的應用

4.1 稀有免疫細胞的分型分析

MiSelect R系統可以對細胞進行多重螢光標記及高解析影像分析，從而識別攜帶特定抗原的免疫細胞（圖12）。

圖12. MiSelect R可鑒定稀有免疫細胞的分型【13】。

4.2 與流式細胞儀的靈敏度對比

流式細胞儀的檢靈敏度不到十萬分之一，100個/mL全血以下的細胞就很難檢測出來了，而且絕大多數流式細胞儀不能提供細胞的影像學資訊。《Nature Medicine》刊文說明在黑色素瘤患者的周邊血中，也能發現新抗原特異性的淋巴細胞；與腫瘤組織內部相比，外周血（PBMC）中的PD-1+CD8+的T細胞數量非常少，流式細胞儀幾乎無法檢測到【14】。MiSelect R系統不僅可以檢測到CD3(+)CD8(+)T細胞，CD3(+)PD-1(+)T細胞，CD8(+)PD-1(+)T細胞，並且對罕見細胞亞型靈敏度更加突出（圖13），可檢測、分析含量在100個/mL以下的稀有功能性免疫細胞。另外，使用流式細胞儀需對樣本進行前處理，如梯度離心取白細胞層染色，可能丟失稀有免疫細胞；而MiSelect R系統直接對全血進行染色標記，將丟失細胞的可能性降到最低。

圖13.對於非常稀有的免疫細胞，MiSelect R可以檢測出來，而流式細胞儀無法檢測到【13】。

• 母血中胎兒有核紅細胞應用:MiSelect R在三例懷孕母親血液中，成功分離出迴圈胎兒有核紅細胞（fNRBC）。

圖 14.母體外周血中的胎兒有核紅細胞【12】。

MiSelect R的特點小結

• 快速全血樣本上樣，無需細胞裂解、密度梯度離心及磁珠篩選，避免遺漏細胞；
• 可作用於全血、胸水、腹水、腦脊液等多種生物樣本；
• 全自動化操作平臺，單機集成，自動富集、純化、螢光標記、影像分析；
• 快速捕獲關鍵生物標誌物資訊，可在同一細胞上標記1-13種生物標誌物；
• 高解析度細胞影像便於判讀分析；
• 可檢測 EpCAM 低表達的腫瘤細胞株，如MDA-MB-231 細胞；
• 重複性高，重複性可達90%以上，CV值低於10%；
• 超高捕獲率>90%，可高達98.5%；
• 特異性100%；
• 可獲得高純度稀有細胞（包括CTCs）（靶細胞純度>60%，挑取單細胞後純度可達到100%）；
• 保留細胞完整性，可進一步提取核酸，獲得基因組資訊；
• 操作簡捷，20 分鐘手動操作，3-4小時完成兩個8mL全血樣本的分析；
• 適用於CTCs、稀有免疫細胞、自身反應性T細胞、淋巴母細胞、母體血液中的胎兒細胞、癌症幹細胞等稀有細胞的計數、鑒定和分離。

總結

MiSelect R獨有的微流道技術結合雷射分選（陽選）、過濾收集（陰選）、多重螢光標記成像分析，可對稀有細胞進行計數、分析、鑒定並獲取活細胞。可用於CTCs研究、癌症藥物的伴隨診斷、稀有功能性免疫細胞研究，或產前無創檢測等領域。其“大海撈針”、“億裡挑一”的強大功能能實現在8mL全血裡回收到僅有的1顆稀有細胞，真正做到超高捕獲率、高靈敏度和100%特異性。

參考文獻：

1. Heller G, McCormack R, Kheoh T, et al. Circulating Tumor Cell Number as a Response Measure of Prolonged Survival for Metastatic Castration-Resistant Prostate Cancer: A Comparison with Prostate-Specific Antigen across Five Randomized Phase III Clinical Trials [J]. Journal of Clinical Oncology, 2018.
2. Sparano J, O’Neill A, Alpaugh, Association of Circulating Tumor Cells With Late Recurrence of Estrogen Receptor–Positive Breast Cancer A Secondary Analysis of a Randomized Clinical Trial [J] JAMA Oncology, 2018.
3. R.Y.Ebright et al., Deregulation of ribosomal protein expression and translation promotes breast cancer metastasis, Science, 367(6485):1468-1473, 2020.
4. 美國AJCC第八版指南
5. Schumacher,T.N.& Scheper,W., A liquid biopsy for cancer immunotherapy, Nature Medicine, Volume22, No.4, 2016, pp.340-341.
6. Gros,G.,et al., PD-1 identifies the patient-specific CD8+ tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors, The Journal of Clinical Investigation, Volume124, No.5, 2014, pp.2246-2259.
7. Thommen,D.S.,et al., A transcriptionally and functionally distinct PD-1+ CD8+ T cell pool with predictive potential in non-small-cell lung cancer treated with PD-1 blockade, Nature Medicine, 24, 994-1004 (2018). https://doi.org/10.1038/s41591-018-0057-z.
8. Jun Wang, Jingwei Sun, et al. Siglec-15 as an immune suppressor and potential target for normalization cancer immunotherapy.[J]. Nature Medicine, 2019. DOI：10.1038/s41591-019-0374-x
9. Singh M., et.al., Lymphoma Driver Mutations in the Pathogenic Evolution of an Iconic Human Autoantibody, Cell, February 13, 2020.
10. MiCareo website：https://www.micareo.com/.
11. Circulating Tumor Cell Enumeration and Multiplexed Biomarker Analysis on the MiSelect R System, Application Note.
12. MiCareo internal clinical materials.
13. Excellent Sensitivity for Immune Cell Detection by the MiSelect R System, Application Note.
14. Gros,A.et.al., Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients, Nature Medicine, published online 22 February 2016.