岑祥生命科學小學堂

細胞培養是生物研究甚至是藥物開發不可或缺的一環，要維持細胞的活性以及正常表現，從挑選適合的細胞株到培養技術都需要格外留意，除此之外細胞的冷凍保存方式更是關鍵，不當的冷凍和解凍步驟，不但有會降低細胞的存活率，更可能改變細胞的特性，而使得試驗前後無法連貫。那麼究竟凍存細胞有那些地方要注意呢?現在就一起來檢視吧~

1. 選擇適合的凍存液成分 

(1) 抗凍劑

當細胞懸浮液溫度低於凝固點的時候，會逐漸形成冰晶，細胞體內的水分也會在降溫過程中滲出而逐漸縊縮，而為了避免細胞過度的縊縮造成失活的現象，凍存液通常會添加甘油或DMSO等低分子量的抗凍劑，快速的滲入細胞並以漸進式凍結細胞，將對細胞的傷害降至最低。

(2) 血清蛋白

牛血清蛋白BSA，能提供額外的生長激素和加強細胞的保護力，針對較敏感的細胞可提升凍存後的存活率。

(3) 無血清配方

去除血清中可能促分化的生長因子，對維持細胞幹性和避免分化是很必要的條件，當使用無血清配方的凍存液時建議以Condition medium:凍存液=1:1的方式，以增加細胞解凍後的存活率。

2. 凍存條件

一般建議在細胞最健康活躍，也就是在對數期(Log phase)進行，細胞密度則建議落在1-2 x10⁶ cell/ mL。

3. 緩慢降溫

前面提到避免細胞快速縊縮失活，所以緩慢的降溫是非常重要的，理想的速率大約是1分鐘降1^oC，若無可調控式的降溫設備則可將細胞存放內含有凍存液的冷凍小管，置於抗凍盒內後移置-80^oC至少24小時，之後再移置液態氮中以低於-130^oC的溫度下進行長時間的保存。

4. 快速解凍活化

再取出凍存的細胞後，要避免融化回溫所形成的冰晶對細胞造成傷害，要盡快置於37^oC的水域槽中溫和地搖晃加速回溫約1-2分鐘，低速離心去除抗凍液再以10倍稀釋加入Fresh medium，活化後的24小時內為細胞存活率的低點，過了24小時後則細胞會逐漸恢復活性。

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