岑祥生命科學小學堂

COVID-19疫情全球性爆發，除了研發新型冠狀病毒(SARS-COV-2)抗病毒藥物及疫苗，在短時間內篩檢出受感染的患者或無症狀感染者對於疫情控管來說更加重要，因此，國際社會努力創建和擴展可用的檢試方法。最近新型體外核酸擴增技術，逆轉錄環介導的等溫擴增（RT-LAMP)，有望提供了一種快速診斷方法。
恆溫環狀擴增法（Loop-Mediated Isothermal Amplification;LAMP）為一恆溫、具環狀形式的擴增法。RT-LAMP檢測通過識別幾個不同的序列目標RNA以高選擇性對其進行擴增，使其靈敏度和特異性相當於傳統PCR方法。有別於傳統PCR所使用的Taq 聚合酶，LAMP檢測使用 Bst 聚合酶。而這聚合酶在65 °C具高DNA strand置換能力，因此LAMP 檢測可在 65 °C恆溫條件下進行。由於減少了一系列溫度循環所，檢測時間減少到大約30-60分鐘。
反應終止後，由於在 LAMP 檢測中，Bst 聚合酶和三對primers識別目標核酸序列的不同位置，當目標核酸被放大後會釋放氫離子，因此可以利用magnesium pyrophosphate沈澱的方式，或利用SYBR Green螢光顯色來判定結果。除此之外，由於在 LAMP 檢測會使pH值改變，因此還可利用pH-sensitive dye產生之顏色改變，透過microplate reader進行檢測。[圖1]

現今COVID-19在世界各地造成大規模疫情，而引起COVID-19的新型冠狀病毒SARS-CoV-2主要是透過接觸及飛沫傳染，目前臨床上多使用鼻咽拭子採樣，並以RT-qPCR偵測檢體中病毒核酸的含量。隨著COVID-19的全球流行性大爆發，如何在短時間內快速又高效地篩檢出SARS-CoV-2便成了至關重要的議題。
面對臨床上海量的病患檢體，檢測人員除了需耗費大量時間處理及檢測檢體外，亦需承受處理檢體時受感染的風險。因此，為了減少操作時間及降低檢測人員受感染的風險，岑祥公司現提供您快速及高效的解決方案──COVID-19半自動檢測流程！

目前已有三千多項關於病毒載體正在進行臨床試驗，其中約10%是以慢病毒載體進行的。慢病毒載體通常是透過多種質體載體瞬時轉染到HEK293T細胞而產生的，病毒會釋放到上清液中，因此要將細胞培養液中的細胞/雜質移除，而在CAR-T研究中則是缺乏建立LV澄清的黃金方法。常規標準使用以離心機分離再進行上清液微孔濾膜澄清，但是僅透過單一步驟的過濾再加上DE助濾劑的輔助，將可有效捕獲和澄清LV，且提高LV純化和T細胞轉導效率。
實驗目的和總結:
主要使用含有矽藻土(DE)之Sartoclear Dynamics^® Lab V50來澄清懸浮細胞HEK293產生的慢病毒載體(Lentiviral vectors, LV)，透過使用實驗設計(DOE)分析Sartoclear Dynamics^®Lab V50和與標準法比較，結果發現:
1. 高濃度DE雖降低感染力價，但有利降低濁度和加快過濾時間。
2. 較低濃度DE有利回收高LV力價。
3. 與標準法比，Sartoclear Dynamics^®Lab V50可更好的將濁度/汙染物降低、提升過濾能力和提升整體膜的使用容量。
4. 相比標準法，更快、更安全進行處理，且減少耗材使用量。
5. Sartoclear Dynamics^®Lab V50適用於捕獲和澄清慢病毒載體。
實驗結果:
一、使用MODDE^® software (Sartorius)在DOE研究中評估DE濃度和接觸時間對濁度、感染力價和過濾時間的影響:
1. 當DE濃度升高，感染力價呈線性下將。
2. 隨著DE濃度的增加，過濾時間減少。
3. 隨著樣品與DE的接觸時間越長，濁度線性降低。

二、評估Sartoclear Dynamics^®Lab V50對處理時間的影響:
1. 使用標準法，大約25ml後，第一個Sartolab^®RF50過濾器堵塞，因此需使用第二個Sartolab^®RF50將剩餘液體過濾，費時費力。
2. 使用Sartoclear Dynamics^®Lab V50因不需再進行離心，可有效降低總處理時間3.8倍。

三、評估Sartoclear Dynamics^®Lab V50對濁度和過濾器容量的影響:
1. 標準法:濁度可至43NTU (89 %降低)。
2. 使用Sartoclear Dynamics^® Lab V50 (5g/L DE)，可將濁度降到21NTU(95%降低)。
3. 搭配最少量5g/L之DE，來確認澄清過濾器的容量，直到過濾阻塞為止，發現Sartoclear Dynamics^®Lab V50 可裝置超過50ml的容量，標準僅約過濾33ml時發生阻塞。

四、評估Sartoclear Dynamics^®Lab V50去除雜質的影響:
1. 約10 g/L的DE會增加蛋白質和dsDNA的移除。
2. 10 g/L~40 g/L之間的較高DE濃度，移除能力沒有明顯增加。
3. 與常規離心後，再澄清方法相比，不論DE濃度為何皆顯著提高雜質移除濾。

★最後跟大家複習如何操作Sartoclear吧!

將矽藻土倒入細胞培養液中進行均勻混合→將過濾裝置與真空馬達相連接→將含有矽藻土之細胞培養液倒入過濾裝置→真空過濾→過濾即完成。
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你是否還在為血清凍融問題所困擾！
未用完的解凍血清是否可以繼續凍存使用！！
多次凍融是否影響細胞生長和血清品質！！！
HyClone 通過科學的實驗資料
來為你“排憂解難”
材料與方法
選取任一批次 HyClone Cosmic Calf™Serum (加強型小牛血清-貨號：SH30413)和 HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (澳洲優級胎牛血清-貨號：SH30084)用於此研究。
(1) 每個批次選取 5 瓶並標記1×到5×
(2) 瓶1×保持凍存狀態，瓶2×至 5×常溫解凍。
(3) 在解凍過程中，每 20-30分鐘混合操作一次。
(4) 待完全解凍後，立即於-20℃ 下重新凍存至隔夜。
(5) 瓶 3×至瓶 5×分別再進行1次、2次、3次凍融。
生長研究
選取 5 種細胞株，測定各個血清的培養性能。表 1 中列出了細胞株及基礎培養基的類型。所有的培養基需添加 10% 的待測血清。針對貼壁細胞，以1.0×104/cm² 的活細胞密度接種到 T25 培養瓶中(三個平行試驗)。當細胞融合率達到90%時，計數。若為懸浮細胞，以 8.0×103/mL 的活細胞密度接種到 T25 培養瓶中，從第三天開始，每天計數一次，直到細胞活率下降(培養條件：37℃ 5%CO2)。
生化分析
所有瓶裝血清樣品進行生化實驗測定，確定血清成分是否有明顯變化。
沉澱分析
比濁法測定樣品中的沉澱物，並通過肉眼檢測的方法判斷多次解凍/凍存是否會增加微粒物質的數量。
表1. 細胞及培養基類型
結果與討論
◉ 圖1到圖5是細胞生長的結果，細胞密度沒有明顯的變化。
◉ 血清生化分析結果(可向岑祥詢問)，血清成分沒有明顯的變化。
◉ 濁度分析結果(表2)表明微粒物質的數量沒有明顯的變化。所有結果都經肉眼確認。
圖 1. MRC-5 細胞生長結果(DMEM +10% FBS(A)或加強型小牛血清(B))
圖 2. VERO 細胞生長結果(DMEM +10% FBS(A)或加強型小牛血清(B))
圖 3. CHO-K1 細胞生長結果(Ham’s F12 +10% FBS(A)或加強型小牛血清(B))
圖 4. FOX-NY 細胞生長結果(DMEM +10% FBS(A)或加強型小牛血清(B))
圖 5. Sp2/0-Ag14 細胞生長結果(DMEM +10% FBS(A) 或加強型小牛血清(B))
表 2. 血清濁度分析結果(多次解凍/凍存)
結論
經過 5 次解凍/凍存迴圈的血清在細胞生長性能、生化分析資料和濁度方面沒有明顯的變化，我們認為血清經多次解凍/凍存迴圈(可達5次)之後，不會影響細胞的生長。雖然測定資料顯示，經過多達 5 次解凍/凍存血清性能並未出現明顯的下降，但反復凍融會造成血清的沉澱增多，給後續處理帶來麻煩，我們建議血清的解凍/凍存次數越少越好。

普遍大家都知道濃縮是藉由超濾膜來進行蛋白質和DNA等濃縮和純化，且可以透過不同膜材質搭配不同樣品特性來提高蛋白質的回收率。
但今天要來告訴大家濃縮管除了濃縮回收步驟外，也可以輕鬆利用濃縮管來透析(去鹽)和緩衝液體的交換。



一般來說，蛋白質可以被合適的超濾膜截留，但鹽類可以自由透過，不受蛋白質濃度和膜分子截留量影響，因此蛋白質濃縮後，濾出液和截留液中的緩衝液成分會保持不變，如此一來，即可利用水或無鹽緩衝液對濃縮物進行稀釋，達到透析的效果；亦可利用新的緩衝液稀釋濃縮物，進而完全置換緩衝物質。
當然Sartorius出產的Vivaspin濃縮管，更可以完美有效的做到濃縮、透析和置換緩衝溶液，因為Vivaspin具有其獨特且出色的特性: