岑祥生命科學小學堂

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Adoptive T-cell therapy (ACT) 逐漸成為治療系統性癌症的趨勢，例如急性淋巴細胞白血病 (acute lymphoblastic leukemia)、血液系統惡性腫瘤 (haematological malignancies) 的治療已紛紛投入ACT研究。由於 T 細胞的擴增和分化對於培養條件的細微差異非常敏感，需要藉由可精密且準確地控制培養參數的生物反應器 (bioreactor) 完成細胞放大。 Applikon 的生物反應器從高通量的篩選型生物反應器、傳統的 small/ large scale 玻璃型槽體，到免去清潔確效、符合細胞治療趨勢的 single-use 槽體，一應具全。同一台控制器即可轉換使用玻璃型/single-use槽體，監控量可達 200 L working volume。應用領域多元，免疫細胞培養優化，也已累積許多可應用於免疫治療 (immunotherapy) 研究成果。
•高通量免疫療法應用的篩選工具-Applikon micro-Matrix
在條件測試初期，藉由高通量系統 micro-Matrix 與實驗設計方法(DOE)的結合，獨立控制24個深孔槽的pH值、溶氧量及溫度條件，短時間且重複性的進行最適合大規模生產T細胞的培養條件。相較pH值與溶氧量，攪動的轉速對T細胞生長的影響最大: 增加攪動至200 rpm可以提高CD4 + central memory cells T 細胞的百分比，且在溶氧量25%，pH值7.4的條件下，細胞量明顯倍數擴增。

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  蛋白質轉譯後修飾(post-translational modification, PTM)在調控生物體內功能扮演重要的角色。在生物體中許多蛋白質生產出來之後並沒有完全的活性，必須在蛋白質上加入一些較小的分子(modifier)，使蛋白質在結構上有局部性的改變而使蛋白質活化具有生物活性，有些修飾作用還具有穩定結構的功能，因此轉譯後修飾為一個十分重要的步驟。大部份修飾作用具有可逆性，故可以調控細胞生理的狀態，轉譯後修飾的分子機制極為複雜，這些修飾包含磷酸化(Phosphorylation)、糖化(Glycosylation) 、泛素化(Ubiquitination) 、甲基化(Methylation)、乙烯化(Acetylation)、硝基化（Nitration）、氫氧根的修飾（Hydroxylation）等。磷酸化(Phosphorylation)是細胞體中最常見的轉譯後修飾，是一種可逆的轉譯後修飾，通常出現在酪氨酸、蘇胺酸及絲胺酸上。蛋白質磷酸化(Phosphorylation)對於調控細胞功能而言是相當重要的，細胞生長、細胞增生、細胞中的訊號傳遞等現象都與蛋白質磷酸化(Phosphorylation)息息相關，為目前蛋白質體學上研究訊息傳遞路徑的重要研究課題。

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幹細胞Exosome對於臨床疾病治療之新發現
近年來科學家們對於Exosome內含物的研究越來越盛行。想要快速探討Exosome裡的蛋白質，當然就需要一項高通量的偵測工具。來自新加坡A*STAR Institute of Medical Biology (IMB)研究機構的Ruenn Chai LAI研究員，利用Raybiotech antibody array工具(圖一)結合LC MS/MS，統計出人類的間質幹細胞Exosome (MSC Exosome)共有857種蛋白質，並利用生物資訊分析軟體 PANTHER，分析出857種部分蛋白質參與了蛋白水解反應，且序列與20S Proteasome序列相似，因此推斷出MSC的Exosome存在20S蛋白酶體。20S蛋白酶體功能為降解不穩定、變性或錯誤折疊的蛋白質。因此Lai團隊推論MSC Exosome具有組織修復的能力。在進一步動物實驗證實，在心肌缺血再灌注myocardial ischemia/reperfusion(MI/R) injury的小鼠中注入MSC exosome，一天後可以明顯降低缺血再灌注所造成的損傷，減少損傷後心臟中錯誤摺疊的蛋白質 (圖二)。由此原理能進一步推斷，MSC exosome不只能降機心肌缺血再灌注所造成的心臟損傷，並且也能緩和由變性蛋白累積引起的疾病，如阿茲海默症、帕金森氏症及普粒子疾病等，此新發現為未來疾病治療將帶來極大的幫助!!

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Exosome是源自體內各種細胞分泌的胞外囊泡，而這些囊泡包含胞內所衍生的生物分子，如蛋白質、脂肪、以及核酸，並且促進生物體內不同型態細胞間通訊的重要介體，藉由分泌的exosome被吸收到近端或是遠端的細胞中，調節受體細胞內的生物功能。
Exosome膜上富有exposed domains的Tetraspanin蛋白〈如CD9、CD63、CD81…等〉並用做於exosome的生物標誌，而這些不同的Tetraspanin蛋白在不同類型的細胞exosome膜上表現出明顯的差異。研究顯示，癌細胞會異常分泌大量的exosome，而癌細胞與正常細胞之exosome中的cargo分子也因為癌症表型而有所不同。這也表示，癌細胞的發展與exosome的數量與當中的cargo分子差異有關。基於正常細胞與癌細胞以上的差異，使用exosome進行癌症的判斷以及針對癌症來源exosome的治療策略也將受到期待。然而治療藥物與策略的開發過程中，闡明其分泌的分子機制及篩選有效抑制劑為一大挑戰，因此，使用高通量與高精確度的exosome定量系統對於將來臨床或是exosome研究領域的發展將是不可或缺。

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      荷蘭大廠 Applikon 設計的 MiniBioreactor 分成 250 mL、500 mL 及 1000 mL 三種不同體積的玻璃槽，經由控制器 my-Control，搭配資訊整合分析軟體 Lucullus PIMS 完成自動化的參數調控及即時分析，目前已在世界各國完成前瞻性的細胞放大應用。my-Control 具有良好的 Scale-up 性能，進行紅血球的培養時，在 MiniBioreactor及 3 L  Bioreactor 的參數控制曲線皆非常一致，且培養9天後 Cell density 為傳統 Flask 培養的2.3倍，活細胞數高達97.8%，高出傳統 Flask 培養40.6%。在細胞治療開放的年代，小型的Single-use Vessel再次風靡，AppliFlex ST 是經由創新的 3D 列印技術製造的拋棄式生物反應器，在顯微鏡下觀察以 AppliFlex ST  與 Glass Bioreactor 培養的 Vero cell ，細胞與 Microcarrier 貼附情況的分布、增殖結果都非常一致。
 

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菌量的檢測多以傳統分光光度計搭配 viable count 進行，根據測量範圍常需要多次取樣、進行多倍數的稀釋。生物放大的過程又需要至少數小時的監控，實驗室人員總是因此每隔一段時間就要進行推菌、大拇哥不停 pipetting 的繁覆作業，甚至隔天又要歷經造成眼睛疲乏的數菌過程。每一次完整的檢測都造成樣本大量損失、實驗量增加、提高汙染風險等經濟效益的降低，這些問題都可以經由 BugLab 的產品獲得解決! BugLab 自2003年成立就一直是生物量監測的創新領導者，利用紅外線引發的細胞散射，收集從細胞中反向散射的光，在線性範圍內無需稀釋處理即可測得生物量，系列產品已應用於生物製藥、生物能源、生物材料、食品飲料，以及微生物學研究等各種產業。
BugLab 目前提供手持式 OD 掃描儀，測量範圍為0-30 OD，以貼靠搖瓶的方式測量時間最長僅需6秒，適用體積廣、不受限於培養槽的材質(玻璃、PC、PET皆可使用)，非常適合進行以 flask 進行小量培養的實驗室，當檢測量大時不再需要多耗費人力進行稀釋，實驗人員有更充裕的時間與體力進行其它測試。另具有RS-232、USB及4-20mA analog output 能與生物反應器系統相連，達成回饋控制的 BE2100，測量範圍0.1-300 OD。各項儀器提供直觀的Windows兼容軟件和USB連接，允許數據下載、分析、校準、參數修改和即時數據收集，BE系列產品除了可以作為獨立設備使用，也能連接至知名大廠 Applikon ez2-Control、my-Control等控制系統進行生物反應器 (bioreactor) 結合應用。Biomass 偵測儀請點我
細菌或細胞的培養在整個生物放大過程，都是以濃縮、萃取生物產物為目的，此時 Sartorius 系列產品成了各實驗室的重要工具。不只是從medium中，在疾病研究上，甚至是尿液中都能進行純化，文獻便指出 Vivaspin 20 能從中獲得約1200 ng/mL總蛋白量。參考文獻請從這裡找

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精準醫學不能只做基因研究，更需探討蛋白質體學
精準醫學技術進入了蓬勃發展的時代，隨著生物科技的進步，基因定序已被作為常規的臨床應用。但是根據許多學者發表，基因組學也僅能顯現臨床情況的一部分。根據史丹佛大學副教授Vinit Mahajan, MD, PhD所言，”基因是靜的，基因不會跟你說疾病甚麼時候是活躍的?甚麼時候停止?甚麼時後開始?對於患者要達到即時疾病狀態的分析，就需要偵測蛋白質”，蛋白質組學研究，比基因組學複雜得多，由於同一基因可編碼多種蛋白質，不同蛋白質的構象變化也會產生不同功能的蛋白，但蛋白質可以揭露更多、更全面的信息。
蛋白質體學研究-應用於精準治療 
- 眼部疾病的應用
一名外科醫生Mahajan舉例，像是人類眼部遭受細菌、真菌、病毒感染或是轉移淋巴瘤，都會造成眼部臨床表現有相似的症狀，但造成此狀況的原因就有四種，就需要四種不同治療方式。此時，若做蛋白質測試，便能節省時間，加速治療。即時有相似的臨床症狀，但蛋白質組學研究都各有不同的表現。近期Mahajan醫師使用了RayBiotech antibody array (圖一)，測試了15名患有相似臨床症狀的眼部疾病及5名健康人類，同時測試200種不同的cytokine。最終發現部分患者有特定的cytokine表現模式，並且發現有此cytokine表現模式的患者都是患有自體免疫性視網膜病變。最後Mahajan醫師運用適當的治療方式，讓這些患者恢復視力。蛋白質組學的分析，使醫生能夠比傳統方法更快地達到診斷。Mahajan醫師表示，通過RayBiotech antibody array (圖一)的技術，分析患者眼液中的蛋白質，幫助他成功選擇合適的藥物，使患者不用經歷漫長、不確定，複雜的治療過程。
圖一、Raybiotech antibody array套組
  - 腎臟疾病的應用
與眼部疾病相比，腎臟疾病更難被發現和診斷，大多數人不會花很多時間思考他們的腎臟感覺。而且人類有兩個腎臟，如果一個有損傷，另一個仍然可以繼續工作。因此，患者在器官開始衰竭之前很難察覺腎臟損傷。?翰霍普金斯大學醫學院腎臟科主任，?Chirag Parikh博士正在研究急性間質性腎炎（AIN)，這是一種腎臟疾病，通常是藥物過敏反應引起。目前，診斷需要腎活檢，這是一種會導致併發症的侵入性手術。如果?有?定性症狀，臨床醫師可能不願意嘗試。為了使診斷更方便，Dr Parikh與他的團隊使用Raybiotech cytokine array，在患者的尿液中檢測出AIN相關的?胞因子IL-9。成功利用IL-9 Biomarker將AIN與其他腎臟疾病區分，並給予適當的治療。
資料來源請點我

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從最基本的細胞培養時的分盤到後續需要精準定量的Assay – 例如ELISA、qPCR、定序等，幾乎所有實驗的先決條件都需要研究人員先取得精確的細胞數目或濃度。今天我們將介紹各種細胞計數法及其優缺點。

1. 血球計數盤

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細胞培養是生物研究甚至是藥物開發不可或缺的一環，要維持細胞的活性以及正常表現，從挑選適合的細胞株到培養技術都需要格外留意，除此之外細胞的冷凍保存方式更是關鍵，不當的冷凍和解凍步驟，不但有會降低細胞的存活率，更可能改變細胞的特性，而使得試驗前後無法連貫。那麼究竟凍存細胞有那些地方要注意呢?現在就一起來檢視吧~

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上一期，我們介紹了HCP ELISA檢測技術，以及美國藥典『USP 39 Published General Chapter <1132> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals』和歐洲藥典『Ph. Eur. 2.6.34 Host cell protein assays』中，都推薦的基於螢光標記的HCP ELISA抗體覆蓋率評估新方法：差異螢光印跡電泳（DIGE/DIBE）技術。本期，我們將詳細介紹下DIBE技術的工作原理、蛋白點配對流程和HCP ELISA抗體覆蓋率的計算方法。

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宿主細胞是生產諸如重組蛋白、抗體藥物或疫苗藥物時最常使用的材料，不同用途的藥物常會採用不同的宿主細胞，如重組蛋白常用的CHO cell (中國倉鼠卵巢細胞)，新型疫苗常使用Vero cell (非洲綠猴腎臟細胞)、MDCK cell (犬腎上皮細胞)及昆蟲細胞等，而傳統疫苗則常會選擇E. coli (大腸桿菌) 或雞胚做為宿主細胞。
然而宿主細胞本身的蛋白質 (Host cell proteins, HCPs) 如果殘留在製劑當中的話，就可能會引發人體的免疫反應，如發熱、紅腫甚至於休克。所引發的症狀及嚴重程度則與HCPs的濃度、數量及每個人免疫系統的差異息息相關。因此HCPs的監控變得越來越重要，也是目前各國藥物主管機關監控的重點項目之一。然而新藥開發的週期長，成功率又低，為了使整體開發流程可以順利執行，因此在新藥開發的中後期就必須非常留意製程設計中HCPs的控制。否則，藥物中HCPs的殘留量將會影響後續臨床試驗的效果，如果出現了免疫反應，還會進而導致臨床試驗延遲、終止甚至得要重新設計製程。即便藥品成功被開發，若是想進入不同國家的市場，就必須符合當地主管機關的要求標準，因此藥廠都需要遵照不同國家的藥典要求，建立嚴格的HCP監控系統。

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